1、無(wú)菌操作室滅菌
培養(yǎng)材料進(jìn)行培養(yǎng)、觀察或更換培養(yǎng)液時(shí),必須從各方面防止任何污染物進(jìn)入培養(yǎng)液或容器,所以無(wú)菌操作室的滅菌是至關(guān)重要的。
由于無(wú)菌操作室的污染來(lái)源主要是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子,因此長(zhǎng)期停用后的無(wú)菌操作室應(yīng)進(jìn)行熏蒸滅菌,熏蒸是用高錳酸鉀+甲醛[(2mL甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]進(jìn)行無(wú)菌室的滅菌。
經(jīng)常使用的無(wú)菌操作室,在每次使用前都應(yīng)進(jìn)行地面衛(wèi)生清潔,并用紫外線燈照射30min,進(jìn)行空氣滅菌。
對(duì)超凈工作臺(tái),每次操作前用紫外燈照射30min,然后用70%~75%酒精擦拭。
2、培養(yǎng)液滅菌
培養(yǎng)液在制備過(guò)程中帶有各種雜菌,分裝后應(yīng)立即滅菌,或在24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。
目前常用過(guò)濾除菌法除去培養(yǎng)物操作液和培養(yǎng)液中的細(xì)菌,或?qū)ε囵B(yǎng)液中耐熱組分先進(jìn)行高壓蒸汽滅菌,然后在無(wú)菌室加入經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌的不耐熱溶液,混勻后分裝備用。液體培養(yǎng)液在冷卻到室溫后再加入過(guò)濾除菌溶液。過(guò)濾除菌時(shí),使用孔徑為0.22~0.45μm或更小的細(xì)菌濾膜。過(guò)濾除菌可利用抽濾裝置或注射過(guò)濾器進(jìn)行,所用器皿均應(yīng)進(jìn)行高壓消毒滅菌,溫度不應(yīng)超過(guò)121℃。
使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時(shí),將分裝好的培養(yǎng)液放入底部有一定量(淹沒(méi)加熱管)涼水的高壓蒸汽滅菌器內(nèi),增壓至0.35~0.4 kg/cm2時(shí)排凈滅菌器內(nèi)冷空氣,以便使蒸汽能到達(dá)各個(gè)消毒部位,保證消毒滅菌徹底。然后繼續(xù)加壓加熱,當(dāng)壓力表讀數(shù)達(dá)到1.0~1.1 kg/cm2為121℃,保持15~20min即可。由于消毒滅菌效果取決于溫度而不是壓力,所以在一定壓力下保持較長(zhǎng)的消毒滅菌時(shí)間是必須的。在121℃的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細(xì)菌及高度耐熱的芽孢桿菌,因此許多培養(yǎng)液的消毒滅菌壓力、溫度一般保持在1.0~1.1 kg/cm2、121℃。消毒滅菌時(shí)間與需要消毒滅菌的培養(yǎng)液量密切相關(guān),時(shí)間不足達(dá)不到滅菌效果,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)培養(yǎng)液內(nèi)的一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞,影響培養(yǎng)液成分。消毒滅菌結(jié)束后,關(guān)閉熱源,只有當(dāng)滅菌器內(nèi)壓力降為零時(shí)才能打開(kāi)放氣閥,排除剩余蒸汽,取出培養(yǎng)液。不可在壓力較高時(shí)打開(kāi)放氣閥,引起減壓沸騰,使容器中液體溢出。
3、玻璃器皿、塑料器皿和器械滅菌
玻璃器皿可進(jìn)行干熱滅菌或高壓蒸汽滅菌,但在蒸汽滅菌后最好及時(shí)烘干水分。
對(duì)不能進(jìn)行高壓蒸汽滅菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡,使用前在無(wú)菌操作臺(tái)面上晾干的同時(shí),用紫外線重復(fù)殺菌。實(shí)驗(yàn)室還可以用環(huán)氧乙烷滅菌袋對(duì)塑料器皿進(jìn)行消毒,消毒后的器皿要充分散氣2~4小時(shí)后才可使用。
無(wú)菌操作所用的各種器械,一般采用干熱或高壓蒸汽滅菌,或用75%酒精浸泡,然后在無(wú)菌操作臺(tái)面上晾干的同時(shí)再用紫外線重復(fù)殺菌;在使用期間可多次對(duì)其進(jìn)行酒精燈火焰灼燒滅菌。
4、培養(yǎng)材料的消毒滅菌
采自動(dòng)物機(jī)體的實(shí)驗(yàn)材料,攜帶著微生物及雜質(zhì),接種前須進(jìn)行表面消毒滅菌,對(duì)內(nèi)部已受微生物侵染的材料應(yīng)予以淘汰。從動(dòng)物機(jī)體采集的某些組織塊,須用消毒劑進(jìn)行浸泡處理,進(jìn)行表面消毒。常用消毒劑有過(guò)氧化氫(10~12%,浸泡5~15 min)、過(guò)氧乙酸(0.05%,浸泡30s~1min)、酒精(70~75%,浸泡2 min)。
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