梯度優(yōu)化是液相色譜方法開發(fā)中非常重要的一個環(huán)節(jié)，有時一個合適的梯度洗脫程序?qū)σ合嗌V分析分離起到四兩撥千斤的作用。
一、建立梯度方法的原因
為什么要用梯度的方式來洗脫呢？混合樣品組分中，必定存在容易分離和不易分離的組分，保留較弱和保留較強的組分。我們建立梯度洗脫程序的目的就在于，將容易分離的組分在洗脫能力較弱的流動相中實現(xiàn)盡快分離，而保留較強的組分在色譜柱內(nèi)停留較長時間，與鍵合相表面發(fā)生充分的相互作用，盡可能地彼此拉開，最后用強洗脫能力的流動相洗脫出來，避免洗脫時間過長。
二、反相液相色譜體系流動相的洗脫能力
反相色譜中如何判斷流動相的洗脫能力呢？在反相體系中，隨著流動相的極性不斷增加（水相的比例在不斷增加），流動相整體的洗脫能力逐漸減弱，而保留時間則在逐漸延長。因此對于容易分離的組分，可嘗試在流動相極性較大的環(huán)境下將其實現(xiàn)分離。
同時，為了提高整個樣品混合組分的分離度，在整個梯度程序內(nèi)，也盡可能使用高比例的水相作為梯度洗脫的起始條件。因此進行一個全新項目的反相條件方法開發(fā)的時候，最常用的初始梯度模式便是在0~40min內(nèi)，進行一個95%水相有機相的線性洗脫。
三、反相液相色譜梯度優(yōu)化中心思路
反相色譜梯度優(yōu)化的中心思路，其實就是盡可能減弱流動相的洗脫能力，從而減少共洗脫的情況。減弱流動相洗脫能力最有效的方式是更換洗脫強度弱一些的溶劑，或者增減流動相中的添加劑。
然而很多情況下是參照既定標(biāo)準(zhǔn)進行實驗，溶劑種類和添加劑的量不便進行過多的調(diào)整，這樣的情況下，還有一個方法可以調(diào)節(jié)流動相的洗脫強度，那就是減緩流動相的變化斜率。
在進行方法開發(fā)梯度優(yōu)化的時候，一定要注意兼容性的問題，包括流動相溶劑彼此之間的兼容性，以及流動相和樣品的兼容性。流動相溶劑選擇上，選擇能夠任意比例互溶的溶劑。若是流動相溶劑不方便更換，則需盡量減緩流動相的變化速率，給有機相和水相（鹽相）更多的時間來互溶。對于樣品來說，流動相的性質(zhì)一定要注意與樣品溶劑能夠兼容，避免出現(xiàn)在進樣后的任意時刻樣品不溶解、析出的情況。
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